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Comprendre Dermatan Sulfate − Interaction du cofacteur II de l’héparine par criblage de bibliothèque virtuelle

Glycosaminoglycanes (GAGs) jouent des rôles critiques dans un certain nombre de processus physiologiques et pathologiques tels que l’hémostase, l’inflammation, la croissance neurale, l’angiogenèse et l’invasion virale. Ces rôles proviennent de leur interaction avec une multitude de protéines.Pourtant, les éléments structuraux qui induisent ces interactions restent insaisissables, sauf peut-être pour l’interaction entre l’héparine et l’antithrombine (AT) 1. Une raison fondamentale de cette mauvaise compréhension est leur diversité structurelle phénoménale. Les GAG sont des copolymères anioniques de résidus de glycosamine et d’acide uronique, qui sont diversement modifiés par sulfatation, acétylation et épimérisation. A ces variations s’ajoutent les structures hélicoïdales multiples adoptées par les chaînes polymériques GAG. Par exemple, le sulfate de dermatane (DS) peut avoir une hélice de 21, 32 ou 83 fois4. En outre, la diversité structurelle est associée à la flexibilité conformationnelle des résidus constitutifs. Par exemple, l’acide iduronique (IdoAp), résidu présent dans la DS et l’héparine, présente quatre conformères principales: 1C4, 4C1, 2SO et OS2.5,6. Cette combinaison de variations configurationnelles et conformationnelles conduit à un nombre exponentiel de topologies GAG. Un calcul simple révèle que 884736 topologies différentes sont possibles pour un hexasaccharide DS, parmi lesquelles un petit nombre peut induire une réponse physiologique. Une approche potentiellement puissante pour traiter les interactions de protéines GAG ∢ est l’analyse computationnelle. Cependant, la modélisation des GAG a été problématique en partie à cause de leur nature polyanionique et de leur faible complémentarité superficielle.7,8 Récemment, nous avons développé une approche de sélection de bibliothèque virtuelle combinatoire (CVLS) utilisant le programme GOLD et une bibliothèque de 6859 séquences d’hexasaccharides de l’héparine.9 L’application de la méthodologie CVLS à la reconnaissance de l’héparine de l’AT a permis d’identifier plusieurs “ la haute affinité et la haute spécificité ” des séquences d’héparine ainsi qu’une description prédite avec précision du mode de liaison du pentasaccharide H5 de l’héparine (Figure 1), en accord avec les relations d’activité H5   Le succès de cette approche pour la paire d’interactions entre l’héparine et l’AT suggère son utilisation possible pour sa paire soeur, le système d’héparine cofacteur II (HCII), qui reste structurellement indéfini et moins bien compris au niveau moléculaire. Figure 1 Structures du dermatas sulfate hexasaccharide D6, qui est connu pour se lier à HCII, et H5, qui est connu pour se lier à l’AT. Le système HCII DS a un certain nombre de rôles physiologiques importants.10 − 13 HCII est un l’inhibiteur de la sérine protéinase plasmatique humain (serpine) qui inhibe spécifiquement la thrombine14, une enzyme clé jouant un rôle essentiel dans l’hémostase. La spécificité intrinsèque de l’HCII peut être un avantage unique parce que sa déficience ne semble pas augmenter le risque de thrombose.15 En même temps, la serpine prévient la thrombose artérielle11,12,15,16 HCII est également capable d’inhiber la formation de caillots Malgré ces avantages, aucun anticoagulant utilisant la voie indirecte HCII de régulation de la coagulation n’a encore été développé. L’inhibition de la thrombine par HCII est accélérée de près de 1000 fois en présence de DS. Un hexasaccharide DS D6 rare (figure ​ (figure1) 1) a été montré pour lier HCII avec haute affinité, alors que les séquences DS avec des niveaux plus élevés de sulfatation se lient mal, suggérant une spécificité significative de l’interaction.18,19 Sur trois niveau dimensionnel, HCII est structurellement similaire à AT. Par exemple, Lys114, Lys125 et Arg129, les trois principaux résidus de liaison à l’héparine dans AT, correspondent à Lys173, Lys185 et Arg189 de l’hélice D dans HCII. De même, Arg46, Arg47, Arg132 et Lys133 de AT correspondent à Lys101, Arg103, Arg192 et Arg193 de HCII. Pourtant, H5 (figure ​ (figure1), 1), qui reconnaît AT avec une haute affinité et une haute spécificité, lie mal HCII.20 D’autre part, il est connu que DS n’interagit pas avec Arg103 et Lys173,21 , 22 comme on pourrait s’y attendre sur la base de la similarité structurelle entre AT et HCII. Dans l’ensemble, malgré la disponibilité de nombreuses données biochimiques, la structure du complexe DS II reste inconnue et inexploitée. Dans ce travail, nous prédisons la géométrie de liaison HCII de l’hexasaccharide D6 de haute affinité en utilisant l’approche CVLS que nous avons développée. Plus tôt.9 Pour évaluer comment D6 pourrait interagir avec HCII, nous avons cherché à préparer toutes les topologies possibles de l’hexasaccharide. Ainsi, en utilisant trois plis hélicoïdaux possibles (hélices 21, 32 ou 83), quatre conformères majeurs possibles (1C4, 4C1, 2SO et OS2) pour IdoAp, et le conformère le plus favorisé pour le résidu galactosamine (GalNp) (4C1 ), 192 topologies (3 × 4 × 4 × 4) ont été générées pour D6 de manière combinatoire avec SYBYL en utilisant des scripts SPL (Sybyl Programming Language) internes. La structure cristalline de la forme activée de HCII a été extraite du complexe thrombine S195A thrombine & HCI Michaelis (entrée PDB 1JMO), 23 qui est similaire à celle de l’AT activé.24,25 En raison de son degré élevé de similitude avec le site de liaison à l’héparine dans les études AT et mutagenèse dirigée, la région formée par les hélices A et D a été prédite comme étant le site de liaison pour D6 dans HCII. Notre approche CVLS pour comprendre le interaction de D6 avec HCII utilisé une variation de la stratégie d’amarrage et de notation à double filtre adapté pour l’étude des interactions de protéines GAG ∢ (Figure22) .9 Dans cette stratégie, GOLD a été utilisé pour échantillonner l’interaction possible GOLD utilise une recherche algorithmique génétique dans laquelle une population initiale de 100 orientations D6 ancrées au hasard pour chaque topologie est évaluée par la fonction de notation et itérativement améliorée par un biais pour des scores plus élevés. les solutions pour chaque topologie ont ensuite été soumises à un filtre de spécificité “ dans lequel l’auto-cohérence de l’amarrage, lorsqu’elle est effectuée plusieurs fois, a été évaluée. On a comparé des cycles d’amarrage indépendants (six solutions au total). Les topologies D6 qui avaient un rmsd parmi les six solutions de moins de 2.5 Å ont été jugés être des géométries qui reconnaissent HCII de manière très cohérente. De telles topologies D6 ont été considérées comme “ haute-spécificité ” topologies. Une description détaillée du protocole utilisé est fournie dans l’algorithme Supporting Information.Figure 2CVLS utilisé pour étudier l’interaction de 192 topologies D6 avec HCII. Sur les 192 topologies D6 qui ont été soumises à l’analyse CVLS, seulement 16 ont satisfait le critère de “ haute spécificité &#x0201d ;. Le tableau S1 (voir Informations de support) décrit les interactions des 16 topologies de D6 avec les résidus d’acides aminés clés des hélices A et D dans HCII. La compilation révèle plusieurs caractéristiques frappantes. Parmi les 64 topologies de 83 hélices possibles dans la bibliothèque, aucune n’est ancrée avec “ haute spécificité &#x0201d ;. Sur les 128 topologies restantes, deux 21 et 14 32 hélices satisfont au critère. Les modes de liaison de ces 16 “ haute-spécificité ” les topologies pourraient être séparées en deux grandes familles. Le premier mode de liaison est parallèle à l’hélice D (Figure 3a), un mode presque identique à celui de H5 se liant à AT.24,25. La deuxième famille de topologies D6 interagit avec l’hélice D à un moment donné. angle d’environ 60 ° (Figure ​ (Figure3b) .3b). Seules trois topologies tombent dans la première famille, alors que 13 en constituent la dernière.Figure 3 Modes de liaison passifs de deux topologies D6 avec HCII. Les hélices D et A sont représentées en magenta. Les résidus basiques de HCII sont montrés comme des bâtons, et la séquence D6 est rendue comme une balle et un bâton. (a) Une topologie de liaison parallèle représentative, 32-2SO · … Les topologies D6 qui se sont accostées parallèlement à l’hélice D n’interagissent pas avec Arg189 et Arg193, deux des cinq résidus trouvés importants pour la liaison DS.26 − 28 Dans le même temps, ils engagent Arg103, qui est connu pour ne pas jouer un rôle dans l’interaction DS − HCII.21,29 Ainsi, ces trois topologies ont été exclues. Des 13 topologies liées à ∼ 60 ° angle à l’hélice D, deux avaient une géométrie hélicoïdale de 21 fois, tandis que les autres étaient des hélices de 32 fois. L’orientation de chacune de ces topologies est similaire et interagit fortement avec deux résidus de liaison DS critiques: Arg184 et Arg189.26 Cependant, des différences significatives apparaissent dans les interactions de ces topologies avec d’autres résidus des hélices A et D. Aucune des topologies à 32 hélices interagir avec Lys185, qui est connu pour être un résidu important pour la reconnaissance DS21. En outre, au moins cinq topologies à 32 hélices interagissent avec Arg103, un résidu connu pour ne pas être impliqué dans la liaison à DS.21,29. Les topologies en hélice ont été éliminées. Cela ne laisse que deux topologies à 21 hélices comme géométries de liaison HCII possibles. Parmi ces deux, un seul, c’est-à-dire 21-OS2 · 1C4 · 1C4, interagit avec les cinq résidus d’acides aminés clés connus pour être impliqués dans la liaison à HCII (Figure 3b), 3b) , tout en n’interagissant pas avec Arg103 et Lys173, qui ne sont pas impliqués dans la reconnaissance de HCII (voir le tableau S1 dans les informations de support). La topologie 21-OS2 · 1C4 · 1C4 satisfait toutes les données biochimiques connues. Cette géométrie de liaison, présentant un ∼ 60 ° angle avec l’hélice D, est radicalement différente de celle du pentasaccharide H5 se liant à AT, malgré un fort degré de similarité structurelle et de séquence entre les deux serpines. Une question clé à résoudre est de savoir si les états rotamériques des résidus d’acides aminés, en particulier les Lys et Arg positivement chargés impliqués dans la liaison, sont susceptibles d’affecter le résultat de l’étude computationnelle.A priori, les résidus Lys et Arg exposés à la surface sont susceptibles de présenter de multiples états rotamériques; cependant, la majorité des résidus HCII qui interagissent fortement avec la topologie 21-OS2 et 1C4 + 1C4 présentent une conformation de chaîne latérale étendue, qui est la forme préférée en raison des forces stériques et / ou électrostatiques provenant des résidus voisins. Cette restriction conformationnelle introduite par les résidus voisins semble être une raison importante pour la reconnaissance préférentielle de la topologie 21-OS2 · 1C4 · 1C4. Les résidus connus pour ne pas interagir avec DS présentent également une caractéristique similaire. Arg103 est maintenu en place par une rainure hydrophobe formée par des résidus voisins qui limitent sa flexibilité conformationnelle, tandis que Lys173 est si loin que sa flexibilité de chaîne latérale ne jouera aucun rôle. Ainsi, il est peu probable que les états conformationnels des chaînes latérales constituant le site de liaison DS modifient radicalement le résultat de l’étude CVLS.Support pour la validité du “ hit ” 21-OS2 · 1C4 · La topologie 1C4 est fournie par des études conformationnelles de DS en solution. Par exemple, Scott et al. rapportent que DS adopte une conformation hélicoïdale double dans la solution en utilisant la spectroscopie NOE30. De même, Silipo et al. rapport sur l’utilisation de la RMN et l’étude de modélisation moléculaire pour montrer qu’un tétrasaccharide DS, très similaire à D6, existe sous la forme de quatre espèces principales en solution, dont deux ont une conformation hélicoïdale 2 fois.31 De plus, les résidus GalNpN2Ac4S et IdoAp ce tétrasaccharide DS possède des conformations 4C1 et 1C4, respectivement, qui sont similaires aux conformations des résidus présents dans le “ hit ” Topologie D6.31 Un autre test clé de la nouvelle géométrie de liaison D6 est de savoir si elle supporte la complexation ternaire pontée avec la thrombine, un mécanisme important de l’activation DS de HCII.32 Overlaying D6 dans la nouvelle géométrie de liaison (∼ 60 ° D) sur la structure du cocristal de HCII − T (code PDB 1JMO (23)) montre que D6 est orienté dans le sens de la thrombine (figure ​ (figure4) .4). Lorsque la séquence D6 a été prolongée par neuf disaccharides, dans lesquels tous les résidus IdoAp sont dans la conformation 2SO, la chaîne oligosaccharidique DS s’est avérée se croiser avec l’exosite II de la thrombine à Arg93, Arg101 et Lys240 (Figure 44). Figure 4 Comparaison des complexes ternaires pontés par GAG formés par AT − T (ruban jaune et surfaces tan et orange, code PDB 1TB6) et HCII − T (ruban bleu et surface violette; code PDB 1JMO). , AT et HCII, des deux complexes ont été alignés … Exosite II de la thrombine est un domaine de liaison GAG bien étudié qui contribue grandement à HCII ainsi que AT inhibition de la thrombine à travers le mécanisme de pontage. les structures de Tocristal T et HCII − T montrent que bien que les serpines soient étonnamment similaires, la position de la thrombine dans les deux est radicalement différente (Figure ​ (Figure4) .4). L’orientation de l’exosite II est également différente. Le résidu de l’exosite II de la thrombine II Arg233 et Lys125 dans le système AT − T est d’environ 55 &#x000c5 ;, tandis que la distance correspondante entre Arg233 et Lys185 dans le système T de HCII est d’environ 70 &#x000c5 ;. Par conséquent, alors qu’une chaîne GAG ​​parallèle à l’hélice D de AT engagerait l’exosite II dans la thrombine, le même parallélogramme orienté en chaîne de l’hélice D de HCII manquerait complètement la thrombine (Figure 4) .4). En substance, cette analyse supporte fortement un roman 60 ° Pour hélice D géométrie de liaison de D6 sur HCII.Plusieurs aspects de la “ coup ” La géométrie de liaison D6 est intéressante. Dans cette géométrie, tous les 2-OSO3 − les groupes des résidus IdoAp2S (Figure ​ (Figure1) 1) interagissent fortement avec HCII, suggérant une large interface d’interaction. On sait que les résidus IdoAp 2-O-sulfatés sont rares dans les GAG DS. Trois résidus IdoAp2S successifs le sont encore plus.18,19,33 Les interactions étendues de cette séquence rare expliquent pourquoi les séquences GAG DS − (avec IdoAp non sulfaté) sont inactives et supportent l’idée que l’interaction hexasaccharide D6 − HCII est spécifique. En outre, l’inclinaison ∼ 60 ° la géométrie de liaison implique également le 4-OSO3 − groupe d’anneau D et le 6-COO − groupe d’anneau A pour avoir des interactions fortes avec HCII (Figure ​ (Figure5) .5). Des études in vivo chez des souris déficientes en HCII suggèrent que GalpN2Ac4S est important pour l’effet antithrombotique dépendant de HCII 13, ce qui vient étayer cette conclusion. Les résultats conduisent à une hypothèse selon laquelle les variants D6 dépourvus des deux groupes clés (4-OSO3 et D6-COO du cycle A) sont susceptibles de reconnaître HCII avec une affinité faible ou faible. Figure 5Profil des interactions faite par 13 topologies D6 qui lient HCII à ∼ 60 ° Hélice D.Le niveau d’interaction entre D6 et un résidu d’acide aminé a été déterminé par le nombre de distances interatomiques uniques qui sont inférieures à 4,0 Å … La géométrie de liaison implique Arg464, un résidu jusque-là non identifié, comme étant important pour la reconnaissance D6. Nos résultats suggèrent que Arg464 est capable de reconnaître D6 dans les 16 topologies (Figure ​ (Figure5) .5). C’est la première fois que Arg464 a été impliqué dans la reconnaissance spécifique de DS et fournit une hypothèse ferme pour tester la géométrie de liaison dérivée de CVLS. Des études biochimiques avec un mutant Arg464 HCII pourraient être effectuées pour vérifier son implication dans la reconnaissance de D6 et DS. En résumé, notre procédure de criblage virtuel combinatoire a identifié une nouvelle géométrie de liaison pour une séquence DS rare qui lie HCII avec une haute affinité. Les résultats suggèrent que cette liaison est spécifique. La nouvelle géométrie de liaison (∼ 60 ° angle à l’hélice D) prend en charge la liaison de la thrombine à HCII à travers un mécanisme de gabarit. Ceci est la première application du criblage virtuel combinatoire pour les GAGs DS − GAG et permet l’extraction d’un “ pharmacophore ” impliqué dans l’interaction DSII, ce qui aidera grandement la conception rationnelle des agonistes et / ou des antagonistes dirigés contre HCII. Enfin, notre approche devrait être généralement utile pour d’autres interactions serine GAG ​​−