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Prise en charge de la réactivation de l’EBV par le virus d’Epstein-Barr après une greffe de cellules souches allogéniques par analyse simultanée de la charge d’ADN d’EBV et de la reconstitution de lymphocytes T spécifiques d’EBV

Contexte La réactivation EBV du virus d’Epstein-Barr est un événement fréquent après une greffe de cellules souches allogéniques et peut évoluer vers une maladie lymphoproliférative menaçant le pronostic vital EBV-LPD en l’absence d’immunité adéquate des lymphocytes T spécifiques EBV Quantification de la charge ADN EBV chez des individus asymptomatiques Le risque est un indicateur utile mais pas totalement prédictif de la progression vers EBV-LPD et guide pour le traitement préventif des anticorps CD. Méthodes Dans le but d’améliorer l’identification des patients à risque, nous avons analysé rétrospectivement, au sein d’une cohorte de receveurs allogéniques risque pour EBV-LPD, le schéma de la reconstitution des lymphocytes T lors de la réactivation EBV chez tous les patients prétraités patients Résultats In de cas, une reconstitution significative des lymphocytes T à savoir, un nombre de cellules T CD de & gt; Cellules / μL a été documentée pendant la réactivation EBV, qui comprenait une expansion des lymphocytes T mémoire EBV-spécifiques, comme le montre l’analyse des tétramères de l’antigène leucocytaire classe I Des preuves additionnelles pour le potentiel antiviral de cette reconstitution T ont été obtenues prospectivement à partir d’une cohorte de Chez les patients transplantés allogéniques à risque de EBV-LPD, une réactivation EBV est survenue chez des patients traités à la lumière de la reconduction simultanée de lymphocytes T spécifiques à l’EBVConclusion Nous concluons que l’analyse du niveau de reconstitution des lymphocytes T spécifiques à l’EBV pendant La réactivation de l’EBV est un second paramètre important, en plus de la quantification de la charge d’ADN EBV, qui contribuera à une définition plus précise des patients à risque d’EBV-LPD qui, étant donné leur immuno-compétence, dépendra très certainement des interventions préventives

La réactivation de l’EBV par le virus d’Epstein-Barr est fréquente après la réception d’une greffe allogénique de cellules souches alloSCT pouvant évoluer vers une maladie lymphoproliférative EBV-LPD potentiellement mortelle EBV-LPD Les facteurs de risque pour la réactivation EBV et EBV-LPD subséquente comprennent l’utilisation de Dysfonctionnement des cellules T in vitro, globulines antithymocytaires et transplantations de cellules souches non myéloablatives Les symptômes cliniques font souvent défaut aux premiers stades de la réactivation de l’EBV et ne sont souvent reconnus aux stades ultérieurs que s’ils coïncident avec une EBV-LPD progressive. introduction de la PCR en temps réel a fourni un outil puissant pour surveiller la réactivation EBV chez les bénéficiaires de l’alloSCT qui sont encore asymptomatiques et de prédire un risque accru de développer EBV-LPD Les deux stratégies prophylactiques et thérapeutiques ont été signalés soit prévenir ou traiter EBV -LPD, comprenant l’épuisement des cellules B de la greffe et la restauration de l’immunité cellulaire T au moyen de lymphocytes donneurs Récemment, il a été démontré que le traitement préventif par l’ADN de l’EBV dirigé contre la charge avec des anticorps monoclonaux anti-CD déplorant les cellules B rituximab est efficace pour prévenir l’EBV-LPD chez les receveurs d’alloSCT à haut risque. Bien qu’efficace dans la prévention de l’EBV-LPD, le traitement préventif sur la base de la charge d’ADN EBV en tant que paramètre unique entraîne un traitement inutile chez un nombre significatif de patients Parce que EBV-LPD survient seulement en l’absence d’immunité adéquate , nous avons analysé rétrospectivement la reconstitution des lymphocytes T spécifiques de l’EBV lors de la réactivation de l’EBV chez des patients alloSCT pédiatriques ayant reçu un traitement préventif avec des anticorps anti-CD rituximab. Sur la base de ces résultats et d’une cohorte surveillée prospectivement la charge d’ADN de l’EBV et la récupération des lymphocytes T amélioreront l’identification des patients à haut risque d’EBV-LPD

Patients et méthodes

Patients et transplantation La cohorte d’étude rétrospective était constituée d’enfants consécutifs atteints d’une malignité hématologique ou d’une maladie génétique ayant reçu un alloSCT au Centre médical de l’Université de Leiden Leiden, Pays-Bas de janvier à septembre. Le prétraitement des patients était conforme aux protocoles spécifiques Groupes de travail pertinents du Groupe européen pour la transplantation de sang et de moelle osseuse Vingt-cinq enfants étaient considérés à risque de développer EBV-LPD, parce qu’ils avaient reçu une greffe d’une famille séropositive, non apparentée, n = ou non appariée. globuline antithymocyte pendant le conditionnement Imtix [Sangstat]; dose totale, mg / kg Dans certains cas, la manipulation in vitro de la greffe a été réalisée par sélection de CD CliniMACS; Miltenyi ou déplétion des cellules T / B par immunorésetting La cohorte prospective était constituée de receveurs alloSCT pédiatriques consécutifs ayant reçu leurs greffes au Centre Médical de l’Université de Leiden d’octobre à mai noueux. Ces patients étaient considérés à risque d’EBV-LPD, parce qu’ils recevaient une greffe. greffe d’une famille EBV-séropositive, non apparentée n = ou mésappariée n = donneuse et globuline antithymocytaire pendant le conditionnement Dans certains cas, la manipulation in vitro du greffon a été réalisée par sélection de CD CliniMACS ou déplétion des cellules T / B par immunorétection. La prophylaxie de la maladie de l’hôte consistait en cyclosporine A et en méthotrexate pour les receveurs d’alloSCT à cellules T répétées. Aucune prophylaxie antivirale n’a été administrée et tous les patients recevaient une supplémentation en immunoglobulines intraveineuses pendant les mois suivant la réception de la greffe, en fonction du taux de récupération immunitaire. de la réactivation de l’EBV La PCR quantitative en temps réel pour la détection de l’EBV L’ADN dans le plasma a été réalisé comme décrit ailleurs et a été réalisé sur un système de détection PCR en temps réel multicolore Icycler IQ. La charge d’ADN de BioRad EBV a été surveillée chaque semaine pendant les premières semaines après la greffe de cellules souches. transplantation de cellules souches ou plus longtemps, jusqu’à ce que l’ADN EBV est devenu indétectable EBV réactivation a été définie comme se produisant chez les patients avec un PCR positif pour l’ADN EBV dans le plasma Patients avec une charge d’ADN EBV & gt; Des copies / mL à des moments consécutifs ont été considérés comme étant à haut risque de passer à EBV-LPD et ont reçu une perfusion unique de rituximab mg / m. Une deuxième perfusion a été administrée lorsque la réduction de la charge virale était & lt; ordre de grandeur, c’est-à-dire, & lt; log copies / mL dans la première semaine La charge d’ADN EBV a été contrôlée deux fois par semaine jusqu’à obtention d’au moins des résultats négatifs. Reconstitution immunisée et analyse tétramère L’analyse de la reconstitution immunitaire, y compris la coloration tétramère, a été réalisée par cytométrie en flux multicolore. La coloration des lymphocytes a été effectuée en incubant les cellules avec une concentration pré-titrée de tétramère à ° C pendant min. Les cellules ont ensuite été colorées pour des marqueurs de surface par incubation sur de la glace pendant min avec un anticorps anti-CD conjugué à l’allophycocyanine Immunotech et de l’isothiocyanate de fluorescéine Pour l’analyse phénotypique supplémentaire, des cellules colorées au tétramère ont été incubées avec un CDRO DAKO marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine ou un anticorps monoclonal anti-CCR anti-humain BD Pharmingen suivi d’une détection avec un isothiocyanate de fluorescéine IgM anti-souris de chèvre. Anticorps secondaire marqué Southern Biotechnology Associates cytome en flux Les tétramères EBV utilisés dans cette étude sont présentés dans le tableau et ont été générés par l’Institut d’études sur le cancer Birmingham, Royaume-Uni et Sanguin Research Amsterdam, Pays-Bas. a été obtenue dans tous les cas pour la surveillance immunologique et la cryoconservation des cellules mononucléées du sang. L’approbation a été obtenue auprès du comité d’examen institutionnel local.

Vue de la table largeDétails des épitopes de lymphocytes T cytotoxiques restreints de classe I du virus de la maladie d’Epstein-Barr Cycle lytique de l’EBV et protéines latentesTable View largeTéléchargement de diapositivesDétails des épitopes des lymphocytes T cytotoxiques restreints de classe I du virus du cycle lytique EBV du virus d’Epstein-Barr et les protéines latentes

Résultats et discussion

Reconstitution immunitaire générale et spécifique de l’EBV lors de la réactivation de l’EBV Dans une cohorte de receveurs alloSCT consécutifs, ces patients étaient considérés comme à risque de réactivation de l’EBV selon les critères définis dans Patients and Methods La réactivation de l’EBV a été documentée chez ces patients -; La durée médiane de la première réactivation EBV était de plusieurs jours, – jours après la greffe de cellules souches, et le traitement préventif par rituximab a débuté à un délai médian de quelques jours, – jours après l’administration d’un tableau alloSCT. administré en raison d’un manque de réponse après la première perfusion. Une analyse rétrospective de la reconstitution des lymphocytes T génériques et spécifiques à l’EBV a été réalisée chez des patients et une clairance de l’ADN EBV a été observée en l’absence de lymphocytes T significatifs. & lt; cellules / μL; figure et données non montrées Chez les patients restants, une augmentation du nombre de cellules T CD à au moins cellules / μL a été documentée pendant les premières semaines de la réactivation EBV, qui était associée à une diminution soutenue de la charge en ADN du VEB. Cette reconstitution rapide des lymphocytes T comprenait à la fois des cellules CD et des cellules T CD, avec une prédominance de lymphocytes T CD. L’ampleur de la reconstitution des lymphocytes T CD variait entre -fold et -fold pendant la période de réactivation EBV et les données non montrées. % des lymphocytes T CD étaient compatibles CDRO / CCR, avec un phénotype effecteur de mémoire non représenté Une augmentation significative et rapide du nombre de lymphocytes T CD spécifiques d’EBV a été démontrée lors de la réactivation de EBV chez tous les patients chez lesquels le génotype HLA classe I et la disponibilité des lymphocytes cryoconservés nous a permis d’effectuer une analyse avec les tétramères HLA de classe I des patients; figure et données non présentées La valeur maximale des populations individuelles de lymphocytes T CD spécifiques au peptide représentait% -% du pool total de cellules T CD chez ces patients et incluait des réponses aux épitopes EBV latent et lytique. En dehors de la variation biologique, le nombre variable En raison de ces limitations techniques, il reste difficile de déterminer la contribution relative des réponses des cellules T contre des épitopes uniques et latents chez des patients individuels. en considérant que les résultats basés sur le tétramère sont une sous-estimation de la réponse globale des lymphocytes T CD spécifiques à l’EBV, le répertoire cumulé des lymphocytes T CD spécifiques de l’EBV s’étant développé à partir de & lt; cellules / μL à – cellules / μL pendant la réactivation de l’EBV Les différences interindividuelles et peptidiques significatives sont similaires à ce qui a été rapporté pour les patients atteints de mononucléose infectieuse

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients ayant subi une greffe de cellules souches allogéniques alloSCT avec virus Epstein-Barr réactivation EBVTable View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients ayant subi une greffe allogénique de cellules souches alloSCT avec réactivation EBV du virus d’Epstein-Barr

Chez les adultes recevant l’alloSCT à risque et sans traitement préventif, seule une minorité des patients ayant une réactivation de l’EBV passe finalement à l’EBV-LPD. Observation chez les patients pour lesquels la charge d’ADN EBV avait diminué avant la perfusion du rituximab mais en présence de T La reconstitution des cellules confirme la pertinence fonctionnelle de la récupération des lymphocytes TAnalyse simultanée de la charge virale et de la reconstitution des cellules T Une autre preuve que l’évaluation du niveau de reconstitution des cellules T au moment de la réactivation EBV est pertinente pour la prise de décision clinique. de patients consécutifs alloSCT, de ces patients ont été considérés comme à risque pour EBV-LPD, selon les critères définis dans Patients et Méthodes EBV réactivation a été documentée pour% de ces patients patients -; Sur la base d’une expansion significative et rapide des lymphocytes T spécifiques à l’EBV pendant la phase initiale de réactivation de l’EBV, le rituximab a été retenu chez ces patients – la réactivation de l’EBV a été contrôlée et éliminée de la même manière que chez les patients a reçu un traitement supplémentaire avec rituximab figure Parce que la récupération des cellules T était absente CD T nombre de cellules & lt; cellules / μL pendant la période de réactivation de l’EBV chez le troisième patient, le rituximab a été administré à ce patient comme décrit pour les premiers patients et a entraîné la désactivation de la réactivation EBV Au total, nos résultats suggèrent fortement que le besoin d’intervention préventive Dans notre expérience, bien que ce seuil soit arbitraire, une augmentation du nombre de cellules T CD à au moins cellules / μL au cours de la phase initiale de la phase initiale de la réactivation EBV. La réactivation de l’EBV semble être un seuil pratiquement pratique pour déterminer la nécessité d’une intervention préventive chez tous les patients sauf chez les patients et la reconstitution des cellules T CD s’est révélée exclusivement d’origine donneuse pendant la période de réactivation de l’EBV; Contrairement aux autres patients, ces patients ont reçu des greffes à la suite d’un traitement de conditionnement non myéloablatif. L’interruption du traitement par la cyclosporine A a été suggérée comme une intervention préventive efficace pour les patients et les cellules T CD étaient d’origine mixte et autologue. Malheureusement, aucune information n’a été fournie dans cette étude sur les caractéristiques de la reconstitution des lymphocytes T spécifiques à l’EBV avant et après cette intervention. Chez certains de nos patients, la reconstitution des lymphocytes T a été documentée tout en recevant un traitement continu à la cyclosporine A , alors que chez d’autres patients, la ciclosporine A était diminuée. En présence d’une importante reconstitution des lymphocytes T mémoire, l’exigence supplémentaire d’abroger la cyclosporine A pour contrôler la réactivation EBV peut être variable et doit être soupesée contre le risque de provoquer une greffe par opposition à maladie de l’hôte La contribution supplémentaire de l’acyclovir le contrôle de la réactivation de l’EBV est probablement limité et difficile à évaluer car il ne sera pas administré comme une seule intervention thérapeutique. Récemment, Wagner et al ont démontré qu’un traitement rapide reposait sur l’analyse combinée de la charge virale et de l’aspect clinique Cependant, bien que l’EBV-LPD ait été contrôlé avec succès dans tous les cas, des patients ont dû être traités avec des lymphocytes T cytotoxiques EBV. Par conséquent, chez un nombre significatif de patients, la faisabilité générale de cette approche de la gestion de la réactivation EBV peut reposer sur la disponibilité locale de lymphocytes T cytotoxiques EBV de qualité cliniqueLe rôle des réponses des lymphocytes T spécifiques du virus dans le contrôle de l’infection cytomégalovirus chez les receveurs alloSCT est plutôt similaire à ce que nous avons rapporté pour l’infection EBV, et l’évaluation de ces réponses peut être utilisé dans la gestion clinique de l’infection par le cytomégalovirus Cytomegalovi Les cellules T spécifiques de rus se développent rapidement pendant la virémie et sont capables d’empêcher la récurrence ou la persistance de l’infection Similaire à ce que nous avons démontré pendant l’infection par EBV, le pic des réponses des lymphocytes T CD spécifiques au cytomégalovirus une telle réponse définit les patients à risque, qui peuvent bénéficier du transfert adoptif de cellules T spécifiques au virus Des études antérieures ont démontré que le risque d’EBV-LPD est corrélé avec la reconstitution immunitaire générale et spécifique de l’EBV après transplantation de cellules souches [ -] Nos données indiquent qu’une analyse fréquente de la reconstitution immunitaire des cellules T au moment de la réactivation EBV est, en combinaison avec la charge d’ADN EBV, un second paramètre important pour la reconnaissance des receveurs d’alloSCT qui sont à haut risque pour EBV-LPD. améliorer l’identification des patients qui bénéficieront le plus des interventions préventives

Remerciements

Soutien financier Dutch Cancer Society UL – à NEAPotentiel de conflits d’intérêts Tous les auteurs: pas de conflits