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Recherche d’infection primaire par Pneumocystis carinii dans une cohorte de nourrissons normaux en bonne santé

Pour déterminer si Pneumocystis carinii est associé à une maladie clinique chez l’hôte compétent, des nourrissons sains et normaux ont été inclus dans une étude de cohorte prospective au Chili. P carinii a été identifié par des colorations spécifiques et une amplification de l’ADN de la grande sous-unité mitochondriale ribosomale. La séroconversion a été évaluée par dosage immuno-enzymatique d’échantillons de sérum prélevés tous les mois. L’ADN du carinii a été identifié dans les aspirations nasopharyngées obtenues lors d’épisodes d’infection respiratoire légère chez% des nourrissons dont les échantillons étaient disponibles. Trois pour cent des nourrissons testés négatifs au P carinii ont eu des épisodes d’apnée. La séroconversion s’est développée chez% des nourrissons qui sont restés dans l’étude en mois et qui sont apparus en l’absence de tout symptôme de maladie en%. P carinii ADN peut être fréquemment détecté chez les nourrissons en bonne santé, et il l’hypothèse selon laquelle ils pourraient être un réservoir infectieux de P carinii dans la communauté Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si P carinii provoque une maladie respiratoire manifeste chez les nourrissons

L’infection primaire par Pneumocystis carinii peut provoquer une pneumonie mortelle chez les nourrissons immunodéprimés par le SIDA, la chimiothérapie anticancéreuse ou la transplantation d’organes et chez ceux qui présentent des troubles congénitaux de l’immunodéficience La survenue de l’infection chez les nourrissons dénutris a également été rapportée. chez les nourrissons dont le système immunitaire est affaibli, les enquêtes sérologiques indiquent que la grande majorité des nourrissons immunocompétents en bonne santé ont une infection primaire au P carinii avant l’âge de Ces études suggèrent que l’infection primaire au P carinii est parmi les infections les plus fréquentes en pédiatrie. d’émettre l’hypothèse que la pneumonie diagnostiquée chez l’hôte immunocompromis ne représente qu’une faible proportion des infections à P. carinii affectant les nourrissons et les enfants. La croyance actuelle est que l’infection primaire chez l’hôte compétent est asymptomatique Cependant, des études antérieures ont été conçues pour examiner la séroprévalence. déterminer la relation entre P ca rinii et maladie aiguë chez les enfants en bonne santé La présence ou non d’un profil cliniquement identifiable est inconnue La maladie causée par P carinii chez les nourrissons en bonne santé peut avoir été négligée parce que P carinii se limite à l’hôte immunocompromis et parce que le diagnostic de P carinii nécessite une procédure invasive non utilisée normalement chez les sujets pédiatriques en bonne santé. Nous avons supposé que l’infection primaire par P carinii provoque une maladie respiratoire manifeste chez le nourrisson en bonne santé et que les manifestations cliniques peuvent être différentes ou moins sévères. Des rapports antérieurs soutiennent notre hypothèse, y compris la démonstration de P carinii chez des nourrissons immunocompétents qui ont subi un lavage bronchoalvéolaire LBA au cours d’une infection des voies respiratoires inférieures parce que leur mère avait le SIDA; la découverte de l’antigénémie de P carinii avec peu de cas histologiquement documentés en% de prématurés atteints de pneumonite; et la découverte de P carinii en% des nourrissons & lt; En outre, nous avons histologiquement documenté P carinii dans les poumons de% -% des nourrissons qui meurent de façon inattendue à la maison pour qui l’autopsie a indiqué le syndrome de mort subite du nourrisson étude de cohorte pour déterminer s’il était possible d’identifier un profil d’infection primaire cliniquement manifeste chez le nourrisson sain et d’évaluer les circonstances de la séroconversion

Méthodes

une infection des voies respiratoires supérieures si un rhume, une rhinopharyngite ou une pharyngite était présente et une infection des voies respiratoires inférieures si le bébé présentait une bronchite, pneumonie ou bronchiolite. L’otite moyenne, l’amygdalite et l’amygdalopharyngite ont été distinguées en tant qu’entités séparées enzyme. cathéter d’aspiration avec orifice de contrôle; une pompe portative d’aspiration a été utilisée, et les sécrétions ont été recueillies dans des tubes stériles bouchés -mLUn volume de mL de solution saline a été ajouté au tube lorsque les sécrétions étaient trop épaisses ou rares, et la moitié du volume final a été utilisée pour détecter P carinii par coloration à l’argent méthénamine de Grocott-Gomori a été extraite comme ci-dessous et conservée à-° C jusqu’à son amplification par ADN. Des radiographies thoraciques ont été obtenues lorsque médicalement indiqué L’étude a été approuvée par la Commission d’éthique de l’École de médecine de l’Université du Chili. Un formulaire de consentement éclairé a été signé par les deux parents pour chaque amplification de l’ADN. Un volume de ~ μL de matériel d’aspiration a été examiné pour P carinii par amplification de l’ADN comme décrit ailleurs En bref, les échantillons ont été digérés C en présence de mM EDTA et% SDS L’ADN total a été purifié et concentré avec l’utilisation du système Pharma-Gen « clean up » Pharma-Gen et récupéré dans un volume de μL Five μL de thi La préparation d’ADN a été utilisée pour l’amplification d’ADN avec des amorces oligonucléotidiques P carinii pAZ-E ‘-GATGGCTGTTTCCAAGCCCA-‘ et pAZ-H ‘-GTGTACGTTGCAAAGTACTC-‘ L’amplification a été effectuée à ° C pendant min, ° C pendant min et ° C pendant min. Pour obtenir un niveau plus élevé de sensibilité et de spécificité, nous avons utilisé les amorces pAZ-X ‘-GTGAAATACAAATCGGACTAGG-‘ et pAZ-Y ‘-TCACTTAATATTAATTGGGGAGC-‘, qui sont internes au premier ensemble d’amorces et spécifiques au P carinii humain. , dans un second tour de PCR , en prenant μL du produit PCR du premier tour. Trente-cinq cycles d’amplification ont été réalisés dans les mêmes conditions que les amorces externes. Les produits PCR finaux ont été séparés sur% gels d’agarose et visualisés avec bromure d’éthidium L’ADN de P carinii amplifié de cette manière avait une longueur prédite de pb. Des témoins négatifs sans ADN matrice ajouté ont été inclus après chaque échantillon pour surveiller la contamination croisée. Un échantillon d’ADN de P carinii humain a été Utilisé comme contrôle positif dans chaque expérience Toutes les manipulations pendant l’extraction et l’amplification de l’ADN ont été effectuées dans des cabinets à flux laminaire, avec des pipettes jetables, des tubes et des aliquotes pour éviter la contamination.Analyse des corps Les échantillons de sérum obtenus séquentiellement à chaque mois ont été étudiés Les déterminations de titre d’anticorps ont été faites par comparaison des lectures ELISA obtenues avec un sonicat brut de poumons de souris infectées par P carinii et un sonicat brut de poumons de souris non infectées démontrées par PCR comme exemptes de P carinii en tant qu’antigène en phase solide Les poumons de souris infectés et non infectés par P carinii ont été homogénéisés et soniqués, puis le surnageant a été clarifié par centrifugation et microfiltration, puis dilué à une concentration en protéines de ~ μg / mL dans du tampon carbonate et utilisé pour revêtir les puits à Linbro. plaques de microtitration à fond plat Flow Laboratories Les plaques ont été incubées, hermétiquement recouvertes, dans une chambre humide à C pour min pour permettre à l’antigène d’adhérer Les puits revêtus ont été bloqués avec du lait sec commercial non gras dans du PBS pour h à ° C ou pendant une nuit à ° C Des échantillons de sérum ont été dilués: dans du PBS contenant% Tween PBS-T; Sigma, et μL / puits de chaque échantillon de sérum a été incubé pendant une nuit à ° C. Les plaques ont ensuite été lavées fois avec PBS-T, et l’anticorps lié a été détecté avec l’anticorps de chèvre contre IgG humaine et IgM conjugué à la phosphatase alcaline Jackson Immunoresearch Laboratories, dilué : dans du PBS-T Après une période d’incubation de -h à ° C, les plaques ont été lavées fois avec du PBS-T et développées par l’ajout de p-nitrophényl phosphate Sigma à une concentration de mg / mL dans du tampon diéthanolamine. standardisés en utilisant une variété d’anticorps monoclonaux et polyclonaux connus pour être spécifiques de P carinii. Les anticorps monoclonaux non pertinents donnent des densités optiques DO de & lt; dans ce format ELISA, un échantillon a été étiqueté comme étant positif si la DO dans le Pc ELISA P de P carinii était & gt ;, avec une DO de & lt; dans l’ELISA en utilisant un OD de poumon de souris non infecté non-Pc; peut-être positif si le DO Pc était – et le DO non-Pc était & lt ;; ininterprétable si l’OD dans les deux était & gt ;; ou négatif si le OD Pc était & lt; Analyse statistique Le logiciel StataCorp STATA a été utilisé pour tester si les épisodes d’infection respiratoire P carinii-positifs et P-carinii-négatifs étaient associés à des diagnostics cliniques spécifiques ou à des symptômes spécifiques, au moyen du test exact de Fisher. les échantillons de lavage naso-pharyngien ADN-positifs ou ADN-négatifs ont été comparés en utilisant la valeur de AP du test t de Student de & lt; était considéré comme significatif

Résultats

De mars à juin, les nourrissons sains de un mois représentent le poids à la naissance, g; gamme, – g; médiane, g ont été recrutés à la clinique de santé ambulatoire Rosita Renard, Système national de santé, à Santiago, Chili Parmi ces nourrissons, ont été perdus de l’étude avant l’âge de mois et ont été perdus entre et mois Les raisons de l’abandon étaient non-conformité avec la prélèvement de sang tous les mois n = et transfert des soins à un établissement dans une autre ville n = Ainsi, les nourrissons sont restés dans l’étude pour & gt; mois et pour & gt; Un total d’épisodes ont été enregistrés au cours de l’étude Quatre-vingt-dix-sept% des infections des voies respiratoires supérieures et% étaient des infections des voies respiratoires inférieuresDétection directe du P carinii dans les échantillons respiratoires Cent soixante-dix-huit échantillons d’aspiration nasopharyngée disponible pour l’analyse d’ADN de% des nourrissons participant à la gamme d’étude, – des échantillons par ADN de P carinii infantile ont été détectés dans des échantillons provenant d’épisodes d’infection respiratoire pour% des nourrissons; Dans le% de ces échantillons, des kystes de P carinii ont également été trouvés par Grocott-Gomori méthénamine-nitrate d’argent coloration Dix-sept des nourrissons qui avaient un échantillon ADN positif P carinii ont un deuxième échantillon rhinopharyngé obtenu Le deuxième échantillon, obtenu à intervalles entre et mois après que le premier échantillon positif a été obtenu, était positif pour P carinii chez ces nourrissons AP carinii ADN nasopharyngée échantillon d’aspiration a été obtenu à partir de nourrissons mois après le premier résultat positif, bien que les échantillons obtenus entre les deux étaient négatif. été positifs deux fois avant que P carinii ne soit détectable des mois après que le deuxième échantillon ait été testé positif, bien qu’aucun symptôme respiratoire n’ait été présent au moment de la prise d’échantillon, le patient

Tableau View largeDownload slideIdentification de Pneumocystis carinii dans des échantillons séquentiels d’aspiration nasopharyngée de nourrissons qui ont eu & gt; épisode d’infection respiratoire P carinii-positiveTable View largeTélécharger slideIdentification de Pneumocystis carinii dans des échantillons séquentiels d’aspiration nasopharyngée de nourrissons qui ont eu & gt; épisode d’infection respiratoire positive au P carinii Les diagnostics cliniques chez les patients avec des échantillons disponibles pour l’amplification de l’ADN n’étaient pas différents pour les épisodes d’infections respiratoires carinii-positives et carinii-négatives Tableau P carinii Les échantillons d’aspiration nasopharyngée ADN-positif étaient plus fréquents chez les nourrissons plus jeunes âgés de – mois; moyenne, mois; médiane, mois; SD, que les échantillons négatifs à l’ADN de P carinii obtenus chez des patients âgés de plusieurs mois; moyenne, mois; médiane, mois; SD, P & lt;

Tableau View largeDownload slideDiagnostic clinique dans les épisodes d’infection respiratoire pour lesquels Pneumocystis carinii était recherché par amplification de l’ADNTable View largeTélécharger DiapositiveDiagnostic clinique dans les épisodes d’infection respiratoire pour lesquels Pneumocystis carinii était recherché par amplification de l’ADNClinicalClinical Signes et symptômes documentés lors d’épisodes d’infection respiratoire P carinii-positifs étaient généralement indiscernables de ceux enregistrés au cours des épisodes P carinii-négatifs, sauf pour l’apnée. Trois des nourrissons avec des infections respiratoires à ADN P carinii ont été amenés à la clinique en raison d’épisodes apnéiques antérieurs, et d’entre eux ont nécessité une stimulation par les parents. Les résultats de l’examen physique étaient normaux chez ces nourrissons sauf pour le coryza léger et la toux sèche minimale, et les radiographies thoraciques n’ont pas été obtenues. Le nourrisson qui nécessitait une table de stimulation, patient était positif pour P carinii à des occasions subséquentes, le dernier étant des mois après le premier prélèvement positif quand il a présenté une apnée

Tableau View largeDownload slide Signes cliniques et symptômes dans les épisodes d’infection respiratoire pour lesquels Pneumocystis carinii était recherché par amplification de l’ADNTable View largeTélécharger les lamesClinical signs and symptoms dans les épisodes d’infection respiratoire pour lesquels Pneumocystis carinii était recherché par amplification de l’ADNSeroconversion ELISA titrage anticorps séroconversion documentée en% de Une fois que la séroconversion a été documentée,% des nourrissons sont restés séropositifs sur tous les échantillons de sérum subséquents, ce qui confirme la reproductibilité de ce test. Sept pour cent des nourrissons séroconvertis ont eu ou des titres négatifs entre les titres positifs Cinquante-trois pour cent des nourrissons avaient au moins documenté l’infection respiratoire jours à des mois médians, jours; moyenne, les jours précédant la séroconversion Ils ont été diagnostiqués comme infections des voies respiratoires supérieures chez les nourrissons et infections des voies respiratoires inférieures chez les nourrissons. Le premier titre ELISA positif a été noté en l’absence de toute maladie respiratoire détectable chez les nourrissons séropositifs suivis la fin de l’étude

Figure View largeTélécharger les présentations des nourrissons présentant des titres ELISA positifs et négatifs d’anticorps anti-Pneumocystis carinii à différents âges dans une cohorte de nourrissons sains enrôlés initialement Parmi les nourrissons testés à des mois,% étaient séropositifs, probablement à cause d’anticorps acquis maternellement Quarante-sept% Figure 2: Grossesse des nourrissons avec des titres ELISA positifs et négatifs d’anticorps anti-Pneumocystis carinii à différents âges dans une cohorte de nourrissons sains enrôlés au début de l’étude testés à des mois d’âge,% étaient séropositifs, probablement à cause d’anticorps acquis maternellement Quarante-sept pour cent des nourrissons et% des nourrissons continuant le suivi avaient séroconverti par et des mois d’âge, respectivementSeroconversion a été détectée dans% des nourrissons avec P carcinome nasopharyngé positif chez les nourrissons qui ser L’ADN de P carinii a été détecté – mois après la séroconversion chez un autre de ces nourrissons Un bébé a eu son premier échantillon de sérum positif obtenu simultanément avec l’aspirat rhino-pharyngien à ADN positif de P carinii Trois des nourrissons avec des échantillons d’aspirats nasopharyngiens P carinii positifs n’ont pas séroconverti Deux d’entre eux avaient encore des titres négatifs après une période de suivi et des mois après la positivité nasopharyngée et étaient sains à la fin de l’étude Le troisième enfant avait une leucémie lymphoblastique aiguë diagnostiquée à l’âge de quelques mois, plusieurs mois après l’obtention de son aspiration nasopharyngée positive au P carinii, et a été retiré de l’étude.

Discussion

Les données sérologiques indiquant que la grande majorité des nourrissons de notre cohorte séroconvertis par des mois sont compatibles avec une exposition précoce à P carinii et sont similaires à ceux des générations précédentes. études Le test sérologique réalisé dans cette étude a été réalisé avec P carinii de souris. Car P carinii de souris peut avoir des différences antigéniques de P carinii , un titre ELISA négatif ne signifie pas nécessairement que les anticorps anti P carinii sont absents, Cependant, nos données de séroprévalence sont similaires aux données précédemment publiées d’études impliquant l’utilisation de P carinii de rat ou humain comme antigène de test la détection de l’ADN de P carinii lors d’épisodes d’infections bénignes des voies respiratoires supérieures ou inférieures au cours de cette étude ne t excluent le point de vue actuel que l’infection primaire par P carinii peut être asymptomatique. Sauf pour les occasions, les nourrissons sans symptômes respiratoires n’ont pas été testés pour le tableau P carinii En outre, la preuve que la séroconversion s’est produite sans antécédent d’infection des voies respiratoires supérieures ou inférieures. les nourrissons séropositifs complétant la période de suivi de l’étude soutiennent que l’infection primaire peut se produire asymptomatiquement chez au moins la proportion de nourrissons. La présence d’infections asymptomatiques chez un certain nombre de nourrissons est en accord avec les résultats de nos études précédentes. associée à un syndrome de mort subite du nourrisson L’analyse des épisodes respiratoires dans les cas identifiés positifs par amplification de l’ADN n’a pas révélé de schéma clinique distinctif, à l’exception possible de l’apnée. Les signes et symptômes rencontrés sont communs à ceux de autres causes, et une relation causale ne peut être es Cependant, les patients avaient des antécédents d’épisodes apnéiques à la présentation. L’examen physique a révélé un coryza léger accompagné d’une toux sèche et discrète chez ces patients, l’ADN de P carinii a ensuite été identifié lors d’un épisode d’infection respiratoire consécutive. en outre, il a été détecté dans l’échantillon de lavage rhinopharyngien pris pendant le suivi alors que le patient était asymptomatique, mois de la première table P carinii ADN-positif, patient Ce patient a nécessité des efforts de stimulation, comme décrit par les parents. L’apparition de l’apnée pourrait s’expliquer par des anomalies caractéristiques du surfactant pulmonaire qui peuvent être induites par l’infection à P. carinii Cependant, chez ces patients, aucun signe de détresse respiratoire n’était présent, une radiographie thoracique n’a pas été réalisée. obtenus, et aucun autre pathogène respiratoire n’a été recherché. L’ADN de carinii a été identifié plus d’une fois Dans tous les cas, à l’exception de l’échantillon mensuel du patient, des prélèvements nasopharyngés subséquents pour l’analyse du P carinii ont été effectués au cours d’infections respiratoires. Les prélèvements rhinopharyngés consécutifs ont été positifs. P carinii ADN jusqu’à des mois à partir du moment où le premier échantillon était positif, suggérant que l’élimination de P carinii après le début de l’infection primaire de P carinii pourrait prendre quelques mois chez certains nourrissons, comme cela a été démontré dans les modèles animaux Le génotypage n’était pas disponible pour évaluer si les types de P carinii identifiés dans des échantillons séquentiels étaient liés. Cependant, des études de patients atteints du SIDA avec des épisodes récurrents de PCP ont suggéré que les souches de P carinii étaient identifiées dans les échantillons. La question du transport limité de P carinii justifie une étude plus approfondie, en particulier si un rôle des nourrissons dans la circulation des organismes P carinii dans la communauté peut être démontré Cette étude fournit des preuves directes de l’infection primaire à P. carinii. Chez les nourrissons immunocompétents sains, il peut être asymptomatique dans au moins% des cas. On ne peut déterminer dans cette étude si la primo-infection à P. carinii cause des maladies respiratoires chez le nourrisson en bonne santé, car les infections respiratoires sont courantes dans ce groupe d’âge. Pour déterminer si P carinii peut directement causer des maladies respiratoires évidentes, il faudra faire des recherches plus approfondies La découverte fréquente de P carinii dans les infections respiratoires chez les nourrissons dans cette étude confirme la possibilité que les nourrissons puissent jouer un rôle dans la circulation et la transmission de P carinii organi sms dans la communauté Les nourrissons pourraient constituer un réservoir infectieux actuellement non reconnu pour d’autres nourrissons sensibles ou pour des patients immunodéprimés à risque de pneumonie grave

Remerciements

Nous remercions particulièrement le Dr Cecilia Roldán et les médecins du personnel et le personnel de la clinique externe Rosita Renard pour les références de patients pour cette étude