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Synthèse et activité biologique des aminoglycosides mono- et di-N-acylés

Les aminoglycosides (AG) sont un

classe puissante d’antibiotiques produits naturels, ciblant la bactérie

ribosome, qui sont efficaces dans le traitement de Gram-positif et

Infections bactériennes à Gram négatif, y compris celles qui accompagnent

D’autres maladies comme le cancer et le VIH1. Plus récemment, les AG ont également été étudiés en tant qu’antifongiques potentiels.

les agents et comme une option de traitement pour les troubles génétiques associés

avec des codons de terminaison prématurés.2,3

d’un certain nombre de mécanismes de résistance qui réduisent

l’efficacité des AG est un obstacle majeur au développement de nouvelles

les membres de cette famille d’antibiotiques. Exemples de mécanismes de résistance

comprennent une augmentation de l’efflux ou une diminution de l’absorption de GA par les cellules bactériennes, 4 modifications de l’ARNr 16S, 5 et l’acquisition d’enzymes modificatrices d’AG (AME) par les bactéries.6 AME, le plus commun de ces mécanismes de

résistance, tendent à être spécifiques vers des GA particuliers. Le produit chimique

modifications des AG par les AME, y compris AG N-acétyltransférase

(AAC), AG O-phosphotransférases (APH), ou AG O-nucléotidyltransférase (ANT), conduisent à une diminution de l’affinité

des AG modifiés pour le ribosome. Alors que nous avons montré qu’un seul

modification chimique ne supprime pas nécessairement tous les antibactériens

activité, 7,8 l’existence d’AME bifonctionnels, tels

comme AAC (3) -Ib / AAC (6 ′) – Ib ′ 9 et AAC (6 ′) – 30 / AAC (6 ′) – Ib ′ 10 de Pseudomonas aeruginosa, AAC (6 ′) – Ie / APH (2 ″) – Ia

de Staphylococcus aureus, 11 et ANT (3 ″) – Ii / AAC (6 ′) – IId de Serratia marcescens, 12 capable d’effectuer deux produits chimiques

modifications sur les échafaudages AG, et celle de l’intracellulaire améliorée

survie (Eis) 13,14 enzyme capable d’acétylations multiples

accroître le besoin de nouveaux AG capables d’échapper à l’action des AME. Deux stratégies principales pour contourner l’activité des AME sur les GA

consistent à (1) développer des inhibiteurs d’AME à utiliser conjointement

avec les AG approuvés actuellement, et (2) apporter de légères modifications

les échafaudages de AG connus pour donner des produits qui restent actifs contre

bactéries, mais ne sont plus modifiés par les AME. Les inhibiteurs des AME ont

été identifiés, 15,16 et certains d’entre eux ont été trouvés capables

d’empêcher la désactivation des GA, 17 − 19 mais des tests biologiques

et les méthodes de coadministration sont encore à l’étude. le

le développement d’AG semi-synthétiques s’est révélé une stratégie efficace

pour surmonter, dans une certaine mesure, le problème de résistance AG. En particulier,

l’incorporation d’un acide γ -amino – β -hydroxybutyrique (AHB),

exemplifié par plazomicin20 et amikacin

(AMK), ou un groupe glycinyle à l’échafaudage de AG connu a été l’un

stratégie réussie utilisée pour contourner les TEA tout en conservant ou en améliorant

sur leurs propriétés antibactériennes.21La synthèse des hydrates de carbone complexes comme les AG, qui comprennent

deux à cinq sucres individuels, est souvent une tâche ardue, et leur

synthèse totale à partir de blocs de construction chimiques de base est rarement efficace

des moyens de développer de nouveaux composés efficaces. De plus, le

nombreuses manipulations de groupes protecteurs nécessaires pour modifier sélectivement

AG connus d’une manière prévisible est également assez difficile en raison de

le grand nombre de groupes amine et hydroxyle avec une réactivité similaire.

Dans la plupart des cas, les rendements globaux des synthèses sont plutôt faibles, nécessitant

grandes quantités de matériaux de départ et de nombreuses étapes pour atteindre un

produit unique. Avec les défis de la synthèse des AG de A à Z,

plusieurs approches ont visé à modifier les AG approuvés actuellement

y compris des modifications à diverses positions telles que les positions 1-, 6 ′ -, 21 2 ″ -, 22 5 ″ -, 23 et 6 ″ -dimensions, 3,24,25, 26,27 et covalent

attachement à d’autres antibiotiques, 23,28 qui ont

tous avaient différents degrés de succès. Ici, nous rendons compte de la facilité

synthèses d’AMK, kanamycine A (KAN), nétilmicine (NET), sisomicine (SIS),

et tobramycine (TOB) mono- et dimodifiée aux 1-, 6 ′ -, et / ou

4 ‴ -amines par des groupements glycinyle, carboxybenzyle et AHB (Schéma 1). Nous établissons le

activités antibactériennes et la réactivité réduite des AME envers

ces nouveaux dérivés AG. Nous identifions également les AME compris dans le

souches bactériennes testées.Série 1A. Structures de

couplage

réactifs (1 – 3) utilisés dans cette étude.

B. Schéma de synthèse illustrant la préparation des composés N-azidoacétyles (4), 6 et 10, la conversion des composés N-azidoacétyles 4 et 6. ..Nous avons déjà montré que c’est possible

acyler, par exemple,

la position 3-N de certains AG et conserver l’activité

contre certaines souches bactériennes tout en réduisant leur susceptibilité

à la modification par les AME, 7 tandis que dans d’autres

cas acylation à cette position est délétère à l’activité antibactérienne.

Ces résultats ont indiqué que l’acylation peut être une bonne méthodologie pour

générer de nouvelles variantes AG actives.8

aussi précédemment rapporté que l’ajout d’un groupe glycinyle à la 6 ′ -position

de TOB aboutit à un dérivé ayant une bonne activité antibactérienne21 et a décidé, dans la présente étude, d’élargir

cette approche à d’autres groupes fonctionnels et AG. Nous avons modifié le

méthodologie rapportée en ralentissant le taux d’addition de l’acylation

réactif et en ajustant le gradient de solvant pendant la purification

processus, ce qui a permis d’améliorer les rendements globaux.

préparé une série de 6 ′ -N-glycinylée

Les dérivés AG (7 – 8 et 12 – 13) et 6 ′, 4 ‴ -di-N-glycinyl-AMK (9) en utilisant un ester activé dans le

sous forme d’O-azidoacétyl-N-hydroxysuccinimide

(1) pour ajouter sélectivement un groupe α -azidoacétyle,

qui a été suivie par la réduction de l’azide dans le

amine (Schéma 1B).

Le composé 1 a été préparé par l’intermédiaire du couplage induit par le N, N ′ -dicyclohexylcarbodiimide (DCC)

de α acide -azidoacétique et N-hydroxysuccinimide

dans THF (Schéma 1A).

La réaction de TOB, KAN, AMK, SIS, ou NET avec 1 en utilisant

carbonate de potassium en tant que base dans un mélange 1: 1 de H2O et

Le MeOH a donné les composés azotés N-azidoacétylés 4 et 5 ainsi que 6 &numsp &numsp   &numsp &numsp &numsp   &numsp #

(6) dans des rendements allant de 26 à 63% après purification

(Schéma 1B). Le dérivé 6 ′ -N-azidoacétylé était le principal produit de chaque

des réactions et a été facilement isolé sous forme pure pour une utilisation dans le

étape synthétique suivante. Dans le cas d’AMK, la réaction d’acylation

s’est produit à un taux relativement égal aux 6 ′ – et 4 ‴ -amine.

Pour cette raison, le composé 6 a été préparé dans le même

la mode comme tous les autres 6 ′ -N-azidoacetylated

composés, mais avec un équivalent molaire supplémentaire de l’acylant

le réactif 1 pour générer 6 ′, 4 ‴ -di-N-azidoacétyl-AMK (6). Dans toutes les réactions, certains

des produits secondaires ont également été générés, comprenant des AG di-N-azidoacétylés ainsi qu’un mélange d’autres composés mono-N-azidoacétylés (c’est-à-dire 6 ′ -, 3-,

ou 1-N-azidoacétyle), mais l’isolement de ces autres

composés mineurs sous forme pure n’était pas réalisable. 6 ′ -N-azidoacetylated composés 4 – 5 et 10 – 11 ainsi que le

6 ′, 4 ‴ -di-N-azidoacétyl-AMK (6) ont tous été isolés sous forme de points uniques sur CCM et utilisés directement dans le

réaction chimique suivante. Pour les composés 4 – 6, les fonctionnalités azides ont ensuite été converties en

amines pour donner les composés 7 – 9 via

hydrogénation catalytique (schéma 1B), et après élimination du catalyseur par filtration

à travers Celite, aucune autre purification n’était nécessaire. Les composés N-azidoacétylés 6 et 11 contiennent tous deux un alcène qui n’est pas compatible avec l’hydrogénation catalytique,

et pour cette raison, ils ont été convertis en leurs équivalents 6N-glycinylés respectifs en utilisant une réaction de Staudinger.

Traitement des composés 10 et 11 avec de la triméthylphosphine

dans un mélange 1: 1 de NaOH aqueux (1 mM) et de THF ont donné les composés 12 et 13, avec un rendement de 67% et de 60%, respectivement

(Schéma 1B). Depuis l’incorporation d’un groupe AHB s’est avéré être un succès

stratégie dans le développement de nouveaux AG, nous avons ensuite tenté d’étendre

la méthodologie actuelle pour incorporer sélectivement le groupe AHB à

les 1- et 6 ′ -positions de TOB et KAN. Les conditions de réaction

similaire à celle pour la préparation des dérivés AG glycinylés,

dans lequel 1 a été remplacé par O – γ -benzyloxycarbonylamino – α -hydroxybutyrate-N-hydroxysuccinimide (2, Cbz-AHB), ont été utilisés

dans nos tentatives de préparer des composés avec des groupes AHB. L’utilisation de la chélation

avec le diacétate de zinc a été montré pour bien fonctionner pour incorporer la protection

groupes à la position 1 de KAN.29 Cependant,

lorsque du diacétate de zinc a été utilisé en combinaison avec Cbz-AHB (2) dans un mélange 5: 1 de DMF et de H2O, seuls les TOB (14) ou KAN (15) modifiés par le N-to (6) ont été générés. L’addition d’équivalents supplémentaires de 2 a conduit à la synthèse des 1,6 ′ -di-N-modified

KAN (16). Dans le cas de TOB, même en présence de

plusieurs équivalents de 2, seul le TOB modifié par 6 ′ -N (14) a été observé. C’est important

noter que la réaction de TOB avec 2, en utilisant le potassium

carbonate comme base dans un mélange 1: 1 de H2O et MeOH, comme

pour la préparation des composés 4 – 6, 10 et 11 aussi efficacement

composé 14 (schéma 1C). L’hydrogénation catalytique des composés 14 et 16 (Schéma 1C) a fourni les produits N-AHB respectifs, 17 & 19. En dernier lieu, pour étudier la

importance de la présence d’une amine

fonctionnalité dans le groupe ajouté aux échafaudages AG, nous avons protégé le

6 ′ -N de TOB avec un groupe Cbz (Schéma 1D). Le O-Cbz-N-hydroxyphtalimide (3) a été synthétisé à partir de N-hydroxyphtalimide et de benzylchloroformate en utilisant Et3N comme base dans du dichlorométhane pour une utilisation en tant que réactif acylant.

(Schéma 1A). 6 ′ -N-Cbz-TOB (20) a été préparé à partir de la réaction

de TOB et composé 3, en utilisant le carbonate de potassium comme

base dans un mélange 1: 1 de H20 et de MeOH. C’est important

de noter qu’une tentative d’utilisation de O-Cbz-N-hydroxysuccinimide à la place du composé 3 n’a pas

l’un des composés désirés 20. Avec nos dérivés AG

généré, nous avons ensuite examiné leur antibactérien

propriétés contre dix souches bactériennes: sept Gram positif, deux

Gram négatif et une mycobactérie (Tableau 1). En général, à l’exception

du composé 19 présentant une activité modérée (MIC = 8 –

μ g / mL) contre Mycobacterium smegmatis MC2 – 155

(J), les deux dérivés AMK ont perdu leur activité antibactérienne.

Cependant, en explorant des dérivés de KAN, nous avons observé que 6 ′ -N-glycinyl-KAN (8) et 6 ′ -N-AHB-KAN (18) avaient au moins une diminution de 64 et de 32 fois

de la valeur de la CMI, respectivement, par rapport au KAN lors de l’essai contre Bacillus anthracis str. Sterne (A). Composés 8 (MIC = 16 μ g / mL) et 18 (MIC = 2 μ g / mL,

au moins une réduction de 64 fois de MIC par rapport au KAN parent)

ont également été trouvés pour inhiber modérément et efficacement la croissance de Staphylococcus aureus ATCC 29213 (E) et M. smegmatis MC2-155 (J), respectivement. Plus

de façon intéressante, 6 ′ -N-glycinyl-NET (13) et 6 ′ -N-glycinyl-SIS (12)

étaient les deux meilleurs agents antibactériens que nous avons générés. Les composés 12 et 13 se sont révélés particulièrement actifs

(Les valeurs MIC vont de ≤ 0,25 à 2 μ g / mL, valeurs qui

sont similaires à ceux des AG parentaux) contre B. anthracis str. Sterne (A), S. aureus ATCC 29213

(E), une souche de S. aureus résistant à la méthicilline (MRSA2, G) et M. smegmatis MC2-155 (J). Ces dérivés SIS et NET, en particulier

le dérivé SIS 12, ont également été trouvés modérément

actif (CMI allant de 8 à 18,8 μ g / mL) contre Listeria monocytogenes ATCC 19115 (D), MRSA1

(F), et Pseudomonas aeruginosa PA01

(JE). Les 6 ′ -N-glycinyl-TOB (7) et 6 ′ -N-AHB-TOB (17) ont démontré une activité antibactérienne exceptionnelle. Ils ont affiché

Diminution de 128 et de 32 fois des valeurs de CMI, respectivement,

à TOB contre B. anthracis str. Sterne (A). Ils ont affiché une diminution de 16 fois de MIC

valeurs, respectivement, lorsqu’ils sont testés contre M. smegmatis MC2-155 (J). Ils étaient également modérément actifs (MIC

= 8 μ g / ml) contre S. aureus ATCC 29213 (E). Les essais du 6 ′ -N-Cbz-TOB (20) ont suggéré que l’ajout d’une amine dans le groupe

échafaudage parent AG est grandement bénéfique que 20 a été trouvé

être inactif contre presque toutes les souches bactériennes testées.Après avoir établi les propriétés antibactériennes de nos dérivés AG,

nous avons ensuite testé leur capacité à potentiellement échapper à l’action des AME

(Figure ​ Figure 11). Nous avons testé

dérivés 7 – 9, 12 – 13 et 17 – 20 contre les N-acétyltransférases AAC (3) -IV de E. coli, 30 AAC (6 ′) – ie en utilisant le bifonctionnel

AAC (6 ′) – Ie / APH (2 ″) – Ia de S. aureus, 11 et Eis de M. tuberculosis, 13 ainsi que contre l’O-phosphotransférase APH (3 ′) – Ia de E. coli. Ces enzymes ont été choisies en fonction des positions modifiées

dans la nature, et l’abondance des enzymes modifiant ces positions choisies.

Eis a été ajouté à la liste en raison de sa capacité à acétyler le 3 ″ -,

6 ′ -, 1-, et 4 ‴ -positions de AGs.14 Il est important de noter que des cinq échafaudages AG

testé (AMK, KAN, NET, SIS et TOB), seuls les dérivés KAN 8 et 18 ont été modifiés par APH (3 ′) – Ia à

60% et 5%, respectivement, par rapport à KAN lui-même. Cela suggère que,

tandis que le groupe glycinyle du composé 8 gêne légèrement

la phosphorylation du 3 ′ -hydroxyle de l’échafaudage KAN,

la plus grande partie AHB du composé 18 presque complètement

empêche APH (3 ′) – Ia de modifier ce dérivé KAN. Tout

d’autres GA ne contenaient pas de 3-hydroxyl

substrats de la phosphotransférase. Lors de l’exploration de l’activité

d’AAC sur nos composés, nous avons constaté que, en général, tous les dérivés AG

ont été modifiés à un taux inférieur à celui de leurs homologues

l’exception du composé 8 où une augmentation de 1,2 fois

en activité a été observée avec Eis seulement. Puisque Eis peut multiacétyler

AG, il n’est pas surprenant que cette enzyme ait le potentiel d’acétyler

6 ′ -N-glycinyl-KAN (8) à un niveau plus élevé

taux que KAN. Fait intéressant, tous nos dérivés ont résisté à la

activité de AAC (6 ′) – C’est-à-dire, l’un des types les plus communs de AAC.

AAC (3) -IV a modifié les AG dérivatisés, en moyenne, à 50% du

taux observé avec les AG parents. Dans l’ensemble, il semble que l’AHB

la dérivatisation est légèrement meilleure pour prévenir l’acétylation et la phosphorylation

que la modification glycinyl.Figure 1Bar graphique affichant l’activité AME en présence

des dérivés AG

généré dans cette étude.Tableau 1 Activité antibactérienne

des AG contre

Diverses souches bactériennes Enfin, pour comprendre un sous-ensemble des mécanismes de résistance

impliqué

dans les souches bactériennes que nous avons testés, nous avons sondé ces souches en utilisant

PCR, pour des gènes d’AME spécifiques: aac (6 ′) – Ib, aac (3) -IV, et aph (3 ′) – Ia (Figure ​ Figure 22). Après analyse du gel, nous avons trouvé que cinq souches, B. anthracis str. Sterne (A), B. cereus ATCC 17788 (B), B. subtilis 168 (C), L. monocytogenes ATCC 19115 (D) et H. influenzae ATCC 51907 (H),

contenait le gène aph (3 ′) – Ia,

deux souches, B. cereus ATCC 17788 (B) et B. subtilis 168 (C), contenues

le gène aac (3) -IV, deux souches, B. cereus ATCC 17788 (B) et MRSA1 (F),

le gène aac (6 ′) – Ib, et

quatre souches, S. aureus ATCC 29213 (E), MRSA2 (G), P. aeruginosa PA01 (I), et M. smegmatis MC2-155 (J), ne contenaient aucun gène pour lequel nous avons sondé. L’analyse PCR était précédemment

effectué pour les souches B et E – G.26 Bien que ces données ne confirment pas

que les protéines associées à ces gènes sont activement exprimées

dans les conditions testées, il nous informe que l’inactivité de

composés sur des souches qui n’ont pas eu un coup positif dans le sondage

les expériences peuvent avoir un moyen de désactiver les AG autres que les AME.

gels (1,5%) utilisés pour déterminer les AME présents dans le

souches bactériennes testées dans cette étude. Les gènes sondés comprennent aac (6 ′) – Ib (pistes 1, 482 pb), aac (3) -IV (pistes 2, 230 pb), et aph (3 ′) – Ia (pistes 3, 624 bp). Souches bactériennes … En somme, une série de nouvelles AMK,

KAN, NET, SIS, et TOB mono- et

diderivatized aux 1-, 6 ′ -, et 4 ‴ -positions avec

les groupes glycinyle, carboxybenzyle et AHB ont été synthétisés et testés

contre un panel de souches bactériennes Gram-positives et Gram-négatives

ainsi qu’une souche de mycobactéries. Dans l’ensemble, nous

trouvé que dans le cas de KAN, le 6 ′ -amine est probablement important

pour la plupart de son activité antibactérienne et donc son affinité

pour la cible du ribosome. La même chose est vraie de la combinaison des

6 ′ -amine et amine terminale de AHB d’AMK. Les meilleurs composés,

en termes de valeurs MIC globales, étaient les composés 12 et 13, 6 &ngr; -N-glycinyl-SIS et dérivés -NET,

respectivement (Tableau 1). SIS et NET ont tous deux montré la meilleure activité antibactérienne globale

dans ces études, ils ont également été modifiés au minimum par les AME testés

dans cette étude, il n’est donc pas forcément surprenant que ce soit le

Cas. Par conséquent, les dérivés SIS et NET semblent être des échafaudages prometteurs

pour une enquête plus approfondie. Achaogen a déjà démontré que

un dérivé du SIS, la plazomicine, est non toxique et peut échapper à l’action

de la plupart des AME. Le travail dans notre groupe est actuellement en cours pour dériver plus loin

Préparation de dérivés de N-phényl-lactame capables de stimuler la neurogenèse et leur utilisation dans le traitement de troubles neurologiques Titre: Préparation de dérivés de N-phényl-lactame capables de stimuler la neurogenèse et leur utilisation dans le traitement de troubles neurologiques troublesPatent / Numéro de demande de brevet: WO2015107053A1Publication date: July 23rd, 2015Priority Application: EP14151754.0Priority date: Janvier 20th, 2014Inventors: Jakob-Roetne, R .; Wichmann, J .; Peters, J. U .; Jagasia, R.Assigné Société: Hoffmann La Roche AGDéséologie: Système nerveux centralCible biologique: Maladies neurodégénératives et neuropsychiatriquesRésumé: La neurogenèse, le processus de génération de nouveaux neurones fonctionnels à partir de cellules souches neurales, se produit dans deux régions neurogènes du cerveau. La première région est la zone sous-granulaire (SGZ) dans le gyrus denté de l’hippocampe. De nouvelles cellules granulaires dentées sont générées dans cette zone. Dans la deuxième zone de neurogenèse, la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux, de nouvelles cellules souches neurales sont converties en neurones fonctionnels qui migrent à travers le système migrateur rostral (RMS) vers le bulbe olfactif. La neurogenèse est très limitée dans d’autres régions du cerveau mais peut être induite après une lésion cérébrale (par exemple un accident vasculaire cérébral). Il a été suggéré que la neurogenèse adulte joue un rôle dans la cognition et les états émotionnels. En outre, la perturbation de la neurogenèse normale peut être un facteur contribuant à la progression d’une gamme de maladies neurodégénératives et de troubles psychiatriques. Diminution de la neurogenèse adulte a été liée au stress chronique, la dépression, la privation de sommeil et le vieillissement. Les antidépresseurs, cependant, favorisent la neurogenèse adulte. A la suite de ces observations et d’autres observations apparentées, il a été suggéré que des composés capables de stimuler la neurogenèse adulte pourraient être utiles en tant qu’agents thérapeutiques pour un certain nombre d’états neurodégénératifs importants et de maladies neuropsychiatriques. Ceux-ci comprennent la schizophrénie, le trouble obsessionnel-compulsif, la dépression majeure, le trouble bipolaire, les troubles anxieux, l’épilepsie, la dégénérescence rétinienne, les lésions cérébrales traumatiques, les traumatismes médullaires, le syndrome de stress post-traumatique, la maladie de Parkinson, la démence. # x02019; s, trouble cognitif léger, dysfonction cognitive induite par la chimiothérapie, syndrome de Down, troubles du spectre autistique, perte auditive, acouphène, ataxie spinocérébelleuse, sclérose latérale amyotrophique, sclérose en plaques, Huntington ’ s maladie, accident vasculaire cérébral et troubles dus à la radiothérapie, au stress chronique ou à l’abus de médicaments neuro-actifs, tels que l’alcool, les opiacés, la méthamphétamine, la phencyclidine et la cocaïne. La présente invention concerne des composés capables de stimuler la neurogenèse et leur utilisation en tant qu’agents thérapeutiques pour les conditions susmentionnées.Classes de composés importantes: Définitions: Het est l’oxazole-5-yle, le pyridin-4-yle ou le pyrazol-4-yle; &#x000a0 ; R1 / R2 sont, indépendamment l’un de l’autre, un hydrogène, un alkyle inférieur, un alcoxy inférieur ou un halogène;   W est – CH2 – ou − CH2CH2 &#x02013 ;;   X est CR3R4 ou NR5;   R3 est hydrogène ou alkyle inférieur;   R4 est &numsp &numsp   (CH2) &numsp &numsp   éventuellement substitué par halogène, alcoxy inférieur, alkyle inférieur substitué par halogène, alcoxy inférieur substitué par halogène ou alkyle inférieur; R5 est CHR-phényle ou CH2CHR-phényle, éventuellement substitué par un halogène, alcoxy inférieur, alkyle inférieur substitué par un halogène , alcoxy inférieur substitué par un halogène ou un alkyle inférieur, ou est -CH-pyridine-2, -3 ou 4-yle; R est un hydrogène ou un alkyle inférieur;   n vaut 0 ou Structures 1.Key: Articles de revue récents: Lindvall O .; Kokaia Z. cellules souches dans les troubles neurodégénératifs humains – le temps pour la traduction clinique? J. Clin. Investir. 2010, 120 (1), 29 et # x02013; 40. [PubMed] Hong H. S .; Kim D. Y .; Yoon K. J .; Son Y.Un nouveau paradigme pour la thérapie des cellules souches: Substance-P en tant qu’agent stimulant les cellules souches. Cambre. Pharm. Res. 2011, 34 (12), 2003 – 2006. [PubMed] Ding Y. X .; Wei L. C .; Wang Y. Z .; Cao R .; Wang X .; Chen L. W. Manipulation moléculaire ciblant la régulation de la différenciation dopaminergique et la prolifération des cellules souches neurales ou des cellules souches pluripotentes. CNS Neurol. Maladies cibles de drogues 2011, 10 (4), 517 et # x02013; 28. [PubMed] Essai biologique: Neural Stem Cell Proliferation Assay: Les propriétés neurogènes de petites molécules sont déterminées sur la base de la prolifération de cellules souches neurales dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (NSC), qui ont été dérivées via une double inhibition smad. La réponse du composé est mesurée par l’augmentation des cellules basée sur les niveaux d’ATP (Promega: CellTiterGlo) après une période d’incubation de 4 jours. Les NSC sont décongelés et dilatés sur trois passages. Le 14ème jour, les NSC sont ensemencées dans des plaques à 384 puits revêtues de polyornithine / laminine à une densité cellulaire de 21 000 cellules / cm2 dans un volume de milieu de 38 ° C. Quatre heures après l’ensemencement cellulaire, des solutions de composés sont ajoutées à un volume de 2 μ L.Les solutions mères des composés (eau, 5% DMSO) sont diluées pour obtenir une réponse dose (11 points, facteur de dilution 2), allant de 8 à 8 nM. Les contrôles sont effectués pour déterminer de manière cohérente les propriétés neurogéniques des cellules.Le témoin négatif (neutre) est le milieu de culture cellulaire (concentration finale en DMSO: 0,25%) .Les témoins positifs sont: Milieux de culture cellulaire + 100 ng / mL FGF2 (concentration finale en DMSO: 0,1 2. Milieux de culture cellulaire + 20 ng / mL d’EGF (concentration finale en DMSO: 0,1%) 3. Milieux de culture cellulaire + 100 ng / mL de Wnt3a (concentration finale en DMSO: 0,1%) Après 4 jours d’incubation à 37 ° C ° C, 5% CO2, la quantité d’ATP par puits est quantifiée. La concentration en ATP est proportionnelle au nombre de cellules. L’ATP est quantifié en utilisant le kit Promega CellTiterGlo. Les réactifs CellTiterGlo contiennent un tampon de lyse cellulaire, de la luciférase thermostable (luciférase recombinante UltraGloTM), du magnésium et de la luciférine. La luciférine réagit avec l’ATP en produisant de l’oxyluciférine, de l’AMP et de la lumière. Le signal de luminescence est proportionnel à la teneur en ATP. La valeur du contrôle négatif (neutre) est déterminée pour chaque plaque de dosage en prenant la moyenne de 16 puits témoins négatifs. La réponse du composé neurogène est calculée pour chaque composé en tant que (composé / témoin négatif) × 100 psychothérapie. Les valeurs de EC150 à partir de la courbe de réponse à la dose sont déterminées pour chaque composé d’essai. L’EC150 est la concentration du composé à laquelle 150% de l’activité de contrôle (100%) est atteinte.Biological Data: Claims: 16 Claims10 Composition of claim claims5 Revendications de la méthode d’utilisation1 Revendication du processusVoir dans une fenêtre séparéeNotesLes auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent. n | none